Какие генетические тесты необходимо выполнить пациентам с диагнозом «рак лёгкого»
Что могут определить генетические тесты и как могут повлиять на лечение рака лёгкого? Когда возникает необходимость в NGS-исследовании, а когда достаточно стандартной панели тестов?
Рассказывают сотрудники научной лаборатории молекулярной онкологии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова – ведущий научный сотрудник, к.б.н. Светлана Николаевна Алексахина и врач-лабораторный генетик, к.м.н. Владислав Ильич Тюрин.
В НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова выполняют молекулярно-генетические исследования для пациентов с различными онкологическими заболеваниями. Молекулярно-генетическое тестирование необходимо для выявления чувствительности или резистентности (нечувствительности) опухоли к терапии, определения генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям.
В зависимости от типа генетического нарушения такие исследования выполняются с использованием различных методик: ПЦР, секвенирования по Сэнгеру, фрагментного анализа, секвенирования нового поколения (NGS).
Одна из наиболее распространенных и злокачественных форм опухолей – рак лёгкого.
Для пациентов с диагнозом «рак лёгкого» лаборатория молекулярной онкологии выполняет панель основных генетических тестов, в соответствии с современными клиническими рекомендациями:
- Мутации в гене EGFR*
- Трансклокации с участием гена ALK*
- Трансклокации с участием гена ROS1
- Трансклокации с участием гена RET
- Делеция 14 экзона гена MET
- Амплификация гена MET
- Трансклокации с участием генов NTRK1, NTRK2, NTRK3
- Амплификация гена HER2
- Мутации в гене BRAF*
- Мутации в гене KRAS
*отмеченные тесты входят в ОМС при коде диагноза МКБ C34
Указанные тесты позволяют определить наличие в опухолевых клетках мишеней для таргетной терапии. В большинстве случаев указанные мутации и транслокации возможно обнаружить с помощью относительно простых ПЦР-тестов. В редких случаях может быть выполнено таргетное NGS-секвенирование.
К сожалению, результат NGS далеко не всегда позволяет назначить таргетную терапию. Чаще всего это связано с тем, что все основные мишени для таргетной терапии анализируются в лаборатории молекулярной онкологии до выполнения NGS с использованием ПЦР-методик.
Информационная справка
Метод NGS (Next Generation Sequencing – секвенирование нового поколения) – это современный метод секвенирования (прочтения) ДНК, который позволяет быстро и точно определить нуклеотидную последовательность. Он основан на параллельном «прочтении» множества коротких фрагментов ДНК, которые затем собираются в целую последовательность при помощи компьютерных алгоритмов.
Важно различать:
– Полногеномное секвенирование – прочтение последовательности всего генома. На сегодняшний день это 3 099 441 038 нуклеотидов («букв») [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000001405.29]. Такое исследование является наиболее полным, но избыточным для применения в клинической практике. Сложности вызывает интерпретация значимости генетических изменений регуляторных участков генома.
– Полноэкзомное секвенирование – прочтение последовательности всех кодирующих участков генома – экзонов. Объем такого исследования значительно меньше: у человека около 23 000 генов, что составляет примерно 30 000 000 нуклеотидов. Такой объем исследования используется в научных исследованиях, а также при необходимости установления причины наследственных заболеваний.
– Таргетное секвенирование – прочтение последовательности отдельных клинически-значимых генов и участков генома. Количество исследуемых при таргетном секвенировании генов может значительно отличаться – от 2–15 до 300–500. Такой вид исследования является оптимальным для клинической практики. Однако важно учитывать, какой именно набор генов будет анализироваться. Существуют таргетные панели для выявления наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, клинически-значимых мутаций в опухолях, транслокаций и др.
Изменяется ли тактика ведения пациента по результатам NGS-тестирования?
В первую очередь это зависит от того, какие генетические нарушения будут обнаружены в результате NGS-исследования.
Важно понимать, что NGS – это длительное и дорогостоящее исследование, которое выполняется не менее месяца, во время которого пациент может ожидать назначения лечения. Поэтому важно, чтобы перед NGS-исследованием пациенту были выполнены базовые генетические исследования для его онкологического заболевания.
Бывают случаи, когда мы в результатах NGS обнаруживаем какую-то стандартную мутацию, которую можно было быстро и легко выявить с помощью обычных тестов.
А бывает и другая ситуация, когда в результате NGS выявляется крайне редкое генетическое нарушение, к которому на данный момент либо ещё не разработана эффективная терапия, либо препарат находится на этапе клинического исследования, которое может быть не всегда доступно для участия пациента.
Таким образом, прежде чем выполнить NGS-исследование необходимо убедиться, выполнен ли пациенту для его диагноза полный спектр стандартных генетических исследований.
При каких видах рака лёгкого целесообразно проводить генетическое тестирование
Генетическое тестирование рекомендовано выполнять пациентам с немелкоклеточным раком лёгкого (НМРЛ).
НМРЛ – это любой тип эпителиального рака лёгкого, кроме мелкоклеточного (МРЛ). На долю немелкоклеточных форм приходится порядка 85% всех случаев рака лёгкого.
Наиболее распространенными типами НМРЛ являются аденокарцинома, плоскоклеточный и крупноклеточный рак лёгкого. Среди них именно в аденокарциномах лёгкого с наибольшей вероятностью можно найти мутацию – мишень для таргетной терапии.
В случае мелкоклеточного рака лёгкого (МРЛ) мы практически не ожидаем обнаружить основные генетические нарушения, характерные для НМРЛ. Однако поскольку бывают сложности с гистологической верификацией опухолей, то мы рекомендуем всё же выполнить стандартную панель тестов. При отсутствии мутаций в данном случае, действительно, может быть рекомендовано выполнение таргетного секвенирования для персонифицированного подбора терапии.
Значимые мутации при раке лёгкого
За последние несколько десятилетий наука значительно продвинулась в изучении причин развития рака лёгкого. Были обнаружены мутации, которые заставляют клетки лёгкого усиленно делиться, они получили название – «драйверные мутации». Такое неконтролируемое деление приводит к избыточному разрастанию ткани и формированию опухоли.
Драйверные мутации приводят к изменению формы (конформации) и функции белков, которые играют существенную роль в жизнедеятельности опухолевых клеток. Против некоторых из таких измененных белков созданы препараты, названные таргетными. Такие лекарства воздействуют прицельно на мишень (на англ. target) – измененный мутантный белок, имеющийся в опухолевой клетке. Применение таргетных препаратов значительно увеличивает эффективность лечения онкологических пациентов.
Цель молекулярной диагностики при РЛ – выявить клинически-значимую драйверную мутацию, после чего пациенту может быть назначена высокоэффективная таргетная терапия.
Важно обратить внимание, что представленные ниже мутации в опухолях лёгкого – соматические. То есть они возникают только в клетках опухоли. Они не являются наследственными. Их можно выявить только в ткани опухоли и поэтому необходимо предоставить в лабораторию соответствующий гистологический материал (парафиновый блок и стекло). Если у пациента обнаружено сразу несколько независимых опухолевых очагов и есть подозрение на первично-множественный рак лёгкого, то в таких случаях рекомендуется отправлять на молекулярно-генетическое тестирование материал каждой опухоли.
Подробнее о мутациях
EGFR-тестирование
Клинически значимые мутации в гене EGFR обнаруживаются в ~15% всех случаев немелкоклеточного рака лёгкого (НМРЛ), а в аденокарциномах до 20%. При такой мутации наблюдается высокая чувствительность к ингибиторам тирозинкиназы EGFR. В данном классе существуют уже несколько поколений препаратов (гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, осимертиниб).
Изначально разработанные тест-системы, которые широко используются в нашей стране, были рассчитаны на выявление только самых частых мутаций в гене EGFR – это аминокислотная замена лейцина на аргинин в 858 кодоне (EGFR p.L858R), а также нуклеотидные делеции в 19 экзоне. Эти мутации чувствительны к препаратам, начиная с первого поколения EGFR-ингибиторов, и тестируются практически повсеместно.
Кроме этих мутаций, существуют более редкие варианты, которые выявляются не всеми тест-системами. В частности, в лаборатории молекулярной онкологии НМИЦ тестируют более редкие мутации: инсерция 20 экзона EGFR, а также замены EGFR p.S719X, p.S768I, p.L861Q, p.T790M и др. Некоторые из повторяющихся мутаций встречаются крайне редко, однако существует вероятность обнаружить новый вариант с неясной клинической значимостью.
Распространенная ошибка – увидеть в молекулярно-генетическом заключении, что обнаружена EGFR-мутация и не обратить внимание на ее вариант при назначении таргетного препарата, в показаниях к применению которого указаны определенные мутации. Одни EGFR-мутации делают опухоль чувствительной к одним препаратам, другие к другим, третьи приводят к формированию резистентности опухоли к проводимой таргетной терапии.
Информация о спектре возможных вариантов мутаций EGFR, их распространенности и клинической значимости публикуется в научных статьях и со временем каталогизируется в базах данных опухолевых мутаций, а также в клинических рекомендациях, что позволяет специалистам быть всегда в курсе новых открытий.
Приобретенная резистентность к анти-EGFR терапии
К сожалению, со временем (обычно через 1,5 года) у пациента, получающего EGFR-ингибиторы, развивается приобретенная резистентность к таргетной терапии.
Механизм этого процесса неплохо изучен. Обычно резистентность формируется в результате приобретения опухолью новых мутаций в гене-мишени терапии, что приводит к изменению конформации белка и снижению эффективности его ингибирования, либо в других онкогенах, мутации в которых активируют параллельные сигнальные пути.
В случае EGFR-терапии чаще всего причиной резистентности является приобретенная (вторичная) мутация p.T790M. В настоящее время к указанной мутации разработано новое третье поколение препаратов. Они эффективны не только по отношению EGFR p.T790M, но и против некоторых других вторичных мутаций, которые мы также определяем.
Исследование вторичных приобретенных мутаций выполняется с использованием актуального опухолевого материал, полученного в результате ребиопсии на фоне прогрессирования заболевания, либо образца плазмы крови (также называют жидкостной биопсией). Для выполнения жидкостной биопсии образец крови собирают в специальные пробирки для анализа свободно-циркулирующей опухолевой ДНК.
Другой распространенной причиной резистентности к анти-EGFR терапии является MET-амплификация (увеличение числа копий гена MET)
Для теста на количество копий гена MET не подходит жидкостная биопсия (образец плазмы крови), необходим именно опухолевый материал (гистологические блоки и стёкла), полученный во время прогрессирования на фоне терапии.
Обнаружение MET-амплификации в опухоли лёгкого позволяет сменить терапию – с той, на которой возникла резистентность, на другую потенциально более эффективную – на препарат кризотиниб.
В крайне редких случаях EGFR-резистентность может развиваться в результате приобретения опухолью RET-транслокации. Данное нарушение стоит искать, только если не были обнаружены EGFR p.T790M и MET-амплификация.
Если причина резистентности не найдена и в этом случае, то тогда может рассматриваться вариант проведения NGS-тестирования с целью поиска других менее изученных причин резистентности.
Однако обнаружение вероятной причины резистентности с помощью NGS далеко не всегда дает возможность назначить лечение пациенту.
Достоинством рутинных молекулярно-диагностических тестов, которые выполняет лаборатория, в том, что для большинства из них существует лечение. При NGS-исследовании же зачастую выявляются генетические нарушения, для которых в настоящий момент не разработано эффективного лечения.
Таким образом, крайне важно определять мутации приобретенной резистентности в опухолях пациентов, прогрессирующих на фоне анти-EGFR терапии.
Какой материал необходим для генетического тестирования при EGFR-резистентности?
Для исследования нам необходим материал, содержащий опухолевые нуклеиновые кислоты. В зависимости от клинической ситуации это может быть:
· опухолевый материал прогрессирующего очага, получаемый в результате повторной биопсии;
· при невозможности выполнения трепанбиопсии можно сделать жидкостную биопсию – забор крови в специальные пробирки с целью последующего получения плазмы, содержащей свободно циркулирующую опухолевую ДНК;
· если прогрессирование произошло вскоре после операции на фоне нео- и последующей адъювантной таргетной терапии, то допустимо предоставить операционный материал удаленного очага;
· в случае первичной резистентности (полное отсутствие ответа на назначенный таргетный препарат) можно предоставить материал исходной опухоли.
В случаях, когда стоит выбор между биопсией первичной опухоли и нового метастатического очага, то выбор напрямую зависит от клинической ситуации, доступности очагов и оценивается лечащим врачом. Однако при возможности рекомендуется исследовать именно прогрессирующий опухолевый очаг. В других случаях – при отсутствии возможности получить актуальный материал – выполняется забор крови для жидкостной биопсии.
Наиболее распространенные ошибки при сдаче и отправке материала для генетического тестирования таких случаев:
· отсутствие важной информации в сопроводительных документах — не указан вариант исходно обнаруженной EGFR-мутации, получал ли пациент таргетную терапию и каким препаратом;
· предоставление первичного материала опухоли, полученного до лечения. В результате в таком образце мы находим только исходную мутацию, которая уже известна пациенту;
· сдача актуального материала после прогрессирования, но без назначения исследования EGFR, а назначены только остальные мутации, характерные для рака лёгкого. Это тоже неправильно, поскольку в большинстве случаев причина резистентности – мутация EGFR p.T790M, а остальные мутации преимущественно являются взаимоисключающими по отношению друг к другу.
KRAS – тестирование
При выявлении мутации в гене KRAS важно определять тип мутации.
Например, мутация KRAS p.G12C связана с чувствительностью к таргетному препарату – соторасибу, доступному для российских онкологических пациентов в рамках клинических исследований и программ расширенного доступа.
Для других типов мутации терапии на данный момент не существует. Однако обнаружение любой мутации KRAS, даже той, которую нельзя использовать для лечения, имеет диагностическое значение. Наличие KRAS-мутации – показатель того, что выполнение дополнительного NGS-профилирования малоперспективно. Драйверные мутации в подавляющем большинстве случаев являются взаимоисключающими событиями.
Мутация KRAS p.G12C также дополнительно может свидетельствовать об эффективности иммуннотерапии. Это связано с тем, что KRAS p.G12C чаще всего встречается у курильщиков, а их опухоли часто являются имунногенными. Таким пациентам стоит выполнить иммуногистохимическое исследование PD-L1 для определения возможности назначения иммунотерапии.
Стоит ли выдавать результат обнаружения мутаций, при которых отсутствует лечение?
Между специалистами существует дискуссия – стоит ли выдавать заключение с выявленными мутациями, при которых отсутствует лечение. На наш взгляд, это необходимо делать, т.к. такие находки могут иметь существенное клиническое значение в некоторых случаях. Это позволяет определить метастатическое или независимое происхождение нового очага. Представим, что у пациента выявлена KRAS-мутация в лёгком и у него через какое-то время будет обнаружен новый опухолевый очаг, то это вызовет у доктора подозрения на метастатическое поражение или рецидив заболевания. В таком можно проверить новую опухоль на эту мутацию. Если ее не будет, то это, крайне вероятно, независимая опухоль, у которой могут быть свои драйверные мутации, которые могут поддаваться лечению.
Также информация о наличии драйверной мутации в целом важна, потому что, даже если сейчас не существует разработанного препарата, то в будущем он может появиться и возможно пациент сможет принять участие в клиническом исследовании или получить расширенный доступ к лекарству.
BRAF – тестирование
Мутация в гене BRAF p.V600E – одна из распространенных мутаций при РЛ, встречается примерно в 4% случаев всех НМРЛ, также существуют и другие более редкие варианты. При обнаружении мутации BRAF p.V600E в опухоли лёгкого рекомендовано назначение комбинации BRAF и MEK-ингибитора – дабрафениба и траметиниба.
HER2–амплификация
Эта амплификация не очень частая – встречается в менее чем 5% случаев. При отсутствии других событий пациентам с этой амплификацией назначают трастузумаб.
Тестирование транслокаций с участием генов ALK, ROS1, RET
В немелкоклеточых опухолях лёгкого могут возникать транслокации – это слияния гена тирозинкиназы (ALK, ROS1 или RET) с геном-компаньоном в один химерный транскрипт. Такого рода мутации также приводят к постоянной активации продукта гена – химерного белка, подобно тому, как это происходит при мутациях в гене EGFR.
Частота транслокаций с участием гена ALK, по обобщённым данным, составляет около 5% от всех случаев НМРЛ, на ROS1- и RET-транслокации приходится порядка 1–2%.
Для всех указанных транслокаций есть возможность назначить таргетные препараты. Основным используемым препаратом в настоящий момент является кризотиниб – препарат 1-го поколения ингибиторов химерных белков ALK и ROS1. Однако со временем может развиться резистентность к кризотинибу вследствие появления точковых мутаций в тирозинкиназном домене генов ALK и ROS1.
По этой причине были разработаны новые препараты – алектиниб (2-е поколение) и лорлатиниб (3-е поколения). Использование этих препаратов позволяет более эффективно ингибировать химерные белки указанных генов, однако со временем и к ним также может развиваться резистентность.
Вместе с тем, также существует отдельный препарат для воздействия исключительно на транслокацию с участием гена RET – селперкатиниб.
Тестирование транслокация генов NTRK1-3
NTRK – это семейство генов рецепторов нейротрофической тирозинкиназы 1, 2, 3. Их трансклокации интересны тем, что могут встречаться практически при любых видах рака, однако с крайне малой частотой. В зависимости от вида опухоли речь идет о десятых долях процента – менее 1%, за исключением опухолей слюнных желез – в 5% случаев. Так в НМРЛ они встречаются с частотой ~0,2%, что является крайне редким событием. Те опухоли, в которых обнаружена NTRK-транслокация очень хорошо отвечают на таргетную терапию энтректинибом и ларотректинибом. В результате этого указанные препараты зарегистрированы как агностические, то есть могут быть назначены вне зависимости от типа NTRK-позитивной опухоли (диагноза).
Транслокация NTRK чаще встречается в редких опухолях и реже в частых. Поэтому в лаборатории молекулярной онкологии выполняется скрининг NTRK-транслокаций в опухолях лёгкого.
Существует суррогатное иммуногистохимическое исследование, которое позволяет выявить экспрессию генов NTRK. При ее наличии обычно рекомендуют верифицировать транслокацию NTRK методом NGS. Это одна из главных причин, почему пациенты с опухолью лёгкого сразу обращаются за NGS-тестированием. В лаборатории молекулярной онкологии исследование транслокаций с участием генов NTRK выполняется как методом ПЦР, так и с помощью NGS.
У каких групп пациентов чаще встречаются те или иные мутации?
Мутации EGFR, ALK, ROS1, RET значительно чаще встречаются у молодых, некурящих и женщин. У пожилых и женщин чаще обнаруживают делецию 14 экзона гена MET, а KRAS-мутацию у курящих пациентов.
Специалисты лаборатории не выбирают тесты, исходя из этих вероятностей, они тестируют в полном объёме все когорты пациентов. Однако эти корреляции позволяют уделить более пристальное внимание случаям, требующим выполнения дополнительных исследований.